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我們邀請臨床執(zhí)業(yè)醫(yī)師解答上述提問,您可以進行追問或是評價
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謝玉蘭 副主任醫(yī)師
東南大學附屬中大醫(yī)院
三級甲等
預(yù)防保健科
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PCR 檢測是一種在醫(yī)學領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的分子生物學技術(shù),用于檢測和分析特定的核酸序列,包括 DNA 和 RNA。它具有高靈敏度、高特異性、快速等特點,在疾病診斷、病原體檢測、基因分型、遺傳疾病篩查等方面發(fā)揮著重要作用。 1. 原理:PCR 檢測基于 DNA 復(fù)制的原理,通過特定的引物與模板 DNA 結(jié)合,在酶的作用下進行多次循環(huán)擴增,使目標核酸片段數(shù)量呈指數(shù)級增加。 2. 應(yīng)用范圍:可用于病原體檢測,如新冠病毒、乙肝病毒等;也用于腫瘤基因檢測、遺傳病診斷等。 3. 優(yōu)勢:靈敏度高,能檢測到微量的核酸;特異性強,準確識別特定序列;快速高效,短時間內(nèi)獲得結(jié)果。 4. 操作流程:包括樣本采集、核酸提取、PCR 擴增、產(chǎn)物檢測與分析等步驟。 5. 注意事項:樣本質(zhì)量至關(guān)重要,操作需嚴格遵循規(guī)范,防止污染影響結(jié)果準確性。 PCR 檢測是現(xiàn)代醫(yī)學中一項重要的技術(shù)手段,為疾病的診斷和治療提供了有力的支持,但檢測過程需要專業(yè)人員嚴格操作和質(zhì)量控制,以確保結(jié)果的可靠性。
2025-03-31 14:10
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回答1
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肖起濤 主治醫(yī)師
家庭醫(yī)生在線合作醫(yī)院
其他
內(nèi)科
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何謂pcr檢測 定量PCR(PolymeraseChainReaction)技術(shù)有廣義概念和狹義概念。廣義概念的定量PCR技術(shù)是指以外參或內(nèi)參為標準,通過對PCR終產(chǎn)物的分析或PCR過程的監(jiān)測,進行PCR起始模板量的定量?! V義概念下的定量PCR技術(shù)可以分為五種類型:(1)外參法+終產(chǎn)物分析。所謂“外參法”是指樣本與陽性參照在兩個反應(yīng)容器內(nèi)反應(yīng)。這種類型沒有對樣本進行質(zhì)控監(jiān)測,易出現(xiàn)假陰假陽結(jié)果,沒有監(jiān)測擴增效率,定量不準。(2)內(nèi)參法+終產(chǎn)物分析。所謂“內(nèi)參法”是指樣本與陽性參照在一個反應(yīng)容器內(nèi)反應(yīng)。這種類型對樣本進行質(zhì)控監(jiān)測,排除假陰結(jié)果,但是定量不準。(3)外標法+過程監(jiān)測。這種類型監(jiān)測擴增效率,陽性樣本定量準,但是無法排除假陰結(jié)果。(4)內(nèi)參法+過程監(jiān)測。由于樣本與陽性參照在一個容器內(nèi)反應(yīng),用同樣的Taq酶和反應(yīng)參與物,存在竟爭性抑制,起始模板量濃度高的反應(yīng)會抑制起始模板量濃度低的反應(yīng),所以定量不準。(5)外標法+過程監(jiān)測+內(nèi)對照。這種類型監(jiān)測擴增效率,陽性樣本定量準,同時排除假陰結(jié)果。這種類型是應(yīng)該提倡的。PCR過程的監(jiān)測有多種檢測模式。最常用的有三種檢測模式:(1)RGreenI檢測模式。溫度循環(huán)為94—55—72°C三步法,只有引物,無探針,熒光染料鑲嵌在雙股螺旋鏈中間。通過對特定方向的強熒光檢測獲得信號,這種試劑檢測模式易產(chǎn)生非特異信號,且本底光較大。(2)解探針模式(Taqman)HydrolysisProbe。溫度循環(huán)為94—60°C二步法,不僅有引物,還有另外一個特異針對擴增模板的探針在引物對之間。在探針相鄰兩個堿基上分別結(jié)合兩個熒光染料,一個染料接受激發(fā)光得到的能量傳給了第二個染料,接受能量的第二個染料通過發(fā)射特征光子回到穩(wěn)定態(tài)。當Taq酶在60°C延伸擴增鏈時,遇到探針,利用Taq酶5`—3`外切酶活性將探針水解成單個堿基,單個堿基之間距離較遠,第一個染料的能量無法傳給第二個染料,只好通過發(fā)射特征光子回到穩(wěn)定態(tài),通過對溶液中第一個染料的熒光檢測獲得信號。這種試劑檢測模式增加了檢測信號的特異性,但是由于利用了Taq酶5`—3`外切酶活性,一般試劑廠家只給Taq酶的聚合酶活性定標,沒有同時給Taq酶5`—3`外切酶活性定標,不同批號試劑之間會給定量帶來差異。另外對探針的熔點溫度(Tm)僅要求其高于60°C,這就使不同試劑盒之間的特異性參差不齊,而且無法做質(zhì)控檢測。(3)雜交探針(HybridizationProbes)模式。溫度循環(huán)為94—55—72°C三步法,有引物,二個特異針對擴增模板相鄰的探針在引物對之間,在一個探針3`堿基上結(jié)合一個熒光染料,在另一個探針5`堿基上結(jié)合第二個熒光染料。在55°C時,兩個探針都剛好接合在模板上,第一個染料接受激發(fā)光得到的能量傳給了第二個染料,接受能量的第二個染料通過發(fā)射特征光子回到穩(wěn)定態(tài),通過對結(jié)合在擴增模板上雙探針中第二個染料的熒光檢測獲得信號。這種試劑檢測模式中熒光信號與特定雜交溫度相關(guān),探針的濃度始終保持不變,因此可以在擴增后檢測熔解曲線作為信號的特異性質(zhì)控。另外這種試劑檢測模式可以用于點突變檢測?! —M義概念的定量PCR技術(shù)(嚴格意義的定量PCR技術(shù))是指用外標法(熒光雜交探針保證特異性)通過監(jiān)測PCR過程(監(jiān)測擴增效率)達到精確定量起始模板數(shù)的目的,同時以內(nèi)對照有效排除假陰性結(jié)果(擴增效率為零)。在國家沒有出臺陰陽判定標準時,所用PCR系統(tǒng)靈敏度最好達到一個拷貝(一個病毒)。從理論上說,只要有一個拷貝數(shù),樣本就算陽性;一個拷貝數(shù)都沒有才算陰性。
2016-01-27 10:01
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